琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。

此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

测定原理

SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-

二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm 处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2．6-DPIP 的还原速度，代表SDH 酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的SDH（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎, 冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体SDH活性测定。

测定步骤和加样表

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）在试剂四中加入18mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴10min；用不完的试剂4℃保存一周；

（2）在试剂五中加入1mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂五和180μL试剂四，混匀，立即记录600nm处20s时的吸光值 A1和1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T

=952×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.385×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10 ⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.77×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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