二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）说明书

NGS Fast DNA Library Prep Set

for Illumina

二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）说明书

目录号：YJ2585

运输条件：干冰运输。

保存条件：-20℃保存。

组分说明

       Size                                10        24         96

       End Prep Enzyme Mix                20μl      48 μl      192 μl

       10x End Repair Reaction Buffer     80μl      200 μl     800 μl

       T4 DNA ligase                      20μl      48 μl      192 μl

       T4 DNA ligase Buffer               160μl     400 μl   2×800 μl

       HiFidelity 2×PCRMasterMix          250μl     600 μl   2×1.2 ml

              本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途  

产品简介

　　本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与

PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相

比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保

真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的 PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可制

备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量

控制和功能验证，zui大程度上保证了文库构建的稳定性。

产品特点

·末端补平，磷酸化，加A一步完成。

·不需纯化，直接加接头。

·超保真扩增，zui大程度上降低了扩增偏好性。

·支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq  2500/2000

  /1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。

自备仪器、试剂和耗材

1．磁力架：建议使用DynaMag            TM-2

                                 (Cat.No. 12321D)。

2．DNA纯化回收试剂盒：建议使用康为磁珠法DNA纯化回收试剂盒 (Cat.No. YJ2508)。

3．样本接头引物试剂盒：建议使用康为二代测序多样本接头引物试剂盒   I/II (Cat. No.

   YJ2586/YJ2587）。

4．无水乙醇，EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去离子水（pH 在7.0-8.0之间）。

5．反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5 ml离心管；

   枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。

实验前准备及重要注意事项

1．避免试剂的反复冻融。

2．PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配

   制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。

DNA建库流程示意图

  2小时40分钟得到DNA文库

1.  DNA末端修复（~50min）

2.  Adaptor连接（~15min）

3.连接adaptor后的DNA片段的选择性回收

    4.PCR扩增 （~15min） 

    5.PCR产物纯化 （30min）                              

补平、磷酸化、加A一步完成

         两步操作一管完成

操作步骤

样本要求：  5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB（10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。

DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修复反应

1．向200μl PCR管中加入以下试剂：

                 试剂名称                             体积

                 10x End Repair Reaction Buffer     6.5μl 

                 End Prep Enzyme Mix              2μl 

                 fragmented DNA                   X（5ng-1μg）

                 RNase-free Water                 Up to 65μl 

2．用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底。

3．将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：

        15 min @ 12℃

        15 min @ 37℃

        20 min @ 72℃

        Hold on 4℃

Adaptor连接

建议使用康为adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方

法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用康为adaptor进行连接的操作步骤：

1．向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：

试剂名称                            体积

T4 DNA ligase buffer for illumina        14  μl

T4 DNA ligase                        2  μl

Adaptor                             2.5  μl

   此时管中溶液总体积为83.5 μl。

   注意：若起始样本量少于100 ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5 μM后使用。

2．用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。

3．20℃温浴15分钟。

   注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。

DNA片段的选择性回收

建议使用上海研谨磁珠法DNA纯化回收试剂盒（YJ2508）进行DNA片段选择性回收。

注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于 50ng，不建议进行DNA片

段选择性回收，可参考说明书第4页，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的

DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1（若

使用除康为以外厂家的磁珠，需自行摸索*磁珠用量）。

以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp（插入片段长度200bp），反

应起始体积为100 μl。

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其*混匀为均一溶液。

2．向连接反应液中加入16.5 μl去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。

   注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去离子水。

3．将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。

4．加入60 μl混合均匀的CMPure，涡旋震荡5秒钟后, 室温静置5分钟。

5．短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5 

   分钟），小心地将上清溶液转移至新的1.5 ml离心管中,并弃去磁珠。

   注意：不要弃除上清。

6．向上清中加入20 μl混合均匀的CMPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。

7．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5 

   分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

   注意：不要弃除磁珠。

8．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250 μl新配置的80%乙醇，室温放

   置30秒，待悬起的磁珠*吸附后，小心弃除上清。

9．重复步骤8。

10.保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

11.将离心管从磁力架上取下，加入 28 μl 10 mM  Tris-HCl（pH 8.0）或去离子水（自

   备），涡旋振荡使磁珠*重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

12.短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需 5分钟），将23 μl洗脱液转

   移至一个新的PCR管中；

   注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。

另一种方案：DNA片段的纯化

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其*混匀为均一溶液。

2．将adaptor连接反应液转移至一新的1.5 ml离心管中。

3．加入1倍样品体积的CMPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。

4．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需

   5分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

   注意：不要弃除磁珠。

5．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入 250 μl新鲜配置的80%乙醇，室

   温放置30秒，待悬起的磁珠*吸附后，小心弃除上清。

6．重复步骤5。

7．保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

8．将离心管从磁力架上取下，加入28  μl EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完

   全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

9．短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需 5分钟），将23  μl洗脱液转

   移至一个新的PCR管中。

PCR扩增

1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。

                       试剂名称                          体积

                       连接adaptor后的DNA片段              23 μl

                       HiFidelity 2X PCR Master Mix          25 μl

                       Univesial primer                      1 μl

                       Index primer                         1 μl

                       总体积                           50 μl

2．PCR反应条件。

                    步骤              温度             时间

                    预变性             98℃            30 s

                    变性              98℃            10 s

                    退火              65℃            30 s    6-16个循环

                    延伸              72℃            30 s

                    终延伸             72℃            5 min

注意：建议1 μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50 ng时10个循环，5 ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。

PCR产物的纯化

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其*混匀为均一溶液。

2．将PCR反应液转移至一新的1.5 ml离心管中。

3．加入1倍样品体积的CMPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。

4．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需

   5分钟）。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

   注意：不要弃除磁珠。

5．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入 250 μl新鲜配置的80%乙醇，室

   温放置30秒，待悬起的磁珠*吸附后，小心弃除上清。

6．重复步骤5。

7．保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

8．将离心管从磁力架上取下，加入30 μl EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠*

   重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

9．短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将洗脱液转移至一

   个新的PCR管中约25 μl，DNA文库在-20℃保存。

文库质量检测

文库浓度

为了得到高质量的测序结果，需要对 DNA文库进行定量，首先推荐使用Real-time 

PCR方法对DNA文库进行定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染

料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。zui终可使用以下近似公式

换算DNA文库的摩尔浓度。

               文库平均总长度         近似转换公式         成簇反应 DNA文库浓度

                  200 bp       1 ng/μl=7.5 nM        6-12 pM

                  300 bp       1 ng/μl=5.0 nM        6-12 pM

                  400 bp       1 ng/μl=3.8 nM        6-12 pM

                  500 bp       1 ng/μl=3.0 nM        6-12 pM

文库长度分布

制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片

段长度分布范围。

               L   S

                    图1：Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果

                 L：DNA Ladder；

                 S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。

    文库结构

    5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC

    GATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNN 

    NNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

    NNNNNN：index, 6bases