pUC-T TA快速连接试剂盒（含载体，连接酶）说明书
pUC-T Quick Ligation Kit
pUC-T TA快速连接试剂盒（含载体，连接酶）
目录号：YJ2591
保存条件：-20℃保存。
组分说明
Cat. No. YJ2591
Size 20次
pUC-T（50 ng/μl） 20 μl
Conctrol Insert (50 ng/μl) 10 μl
Quick T4 DNA Ligase 20 μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer 120 μl
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途
产品简介
pUC-T TA载体是一种克隆PCR产物的载体，它是由pUC18载体在EcoR V
酶切位点处切开，在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在 PCR
产物的3′端添加一个A，它可以与pUC-T 3′端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。
试剂盒中配备率的T4 DNA Ligase和为快速DNA连接优化的2×Quick Ligation
Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片
段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克
隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。
注意事项
1．Insert DNA 要求
1）连接使用的PCR片段3’末端应带有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的 Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2）PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片
段或残存引物等杂质影响。推荐使用 YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒。
2．连接反应要求
1）本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，
增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应 1小时后，转化效率会明显降
低；如25℃快速连接反应过液夜，则转化效率会下降到75%。
2）2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混
匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3）由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将
液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4）如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议
使用离心柱将连接产物进行DNA纯化（如YJ2301快速DNA产物纯化试剂盒）后再
进行电转。
3．感受态细胞要求
建议使用的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需
进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型（F′编码的【lacZ ΔM15】）产生ω片
段，才能与载体DNA产生的LacZ α多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α互补）。
pUC-T TA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司YJ0807 *0感受态细胞、YJ0808 DH5α感受态细胞。
4．阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受
到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白
色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的
读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。
5．阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配
备的Control Insert（750 bp）进行阳性对照实验。
使用方法
1．按以下体系配制反应液：
成分 反应体系 对照体系
pUC-T 1 μl 1 μl
DNA插入片段 * 0.1 -0.3 pmol --
Control Insert DNA -- 1 μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer 5 μl 5 μl
Quick T4 DNA Ligase 1 μl 1 μl
RNase-Free Water 补足至 10 μl 补足至 10 μl
*Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，
可根据实验情况选择适当的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1 ml（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。
2．轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3．反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将 DNA连接
产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4．将连接产物加入50 μl感受态细胞中（将感受态细胞置于冰上融化），冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5．42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6．加入450 μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，
使菌体复苏。
7．根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体
培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，
倒置培养，37℃培养12-16小时。
8．计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。
