注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

规格：100T/96S

产品内容：

试剂一：液体 42mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加 576µL 无水乙醇 (自备) ，24µL 蒸馏水充分溶解。 (变褐色后不能再使用)

标准品：液体 1mL×1 支，0.5 µmol/mL 苯酚标准液，4℃保存。

产品说明：

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转 化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有 效磷含量和 pH 显著影响，根据最适 pH 范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。

碱性环境中，S-AKP/ALP 催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即 可计算出 S-AKP/ALP 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96 孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式 移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取风干混匀土壤约 0. 1g ，加入 0.05mL 甲苯 (自备) ，轻摇 15min ；加 0.4 mL 试剂一并且摇 匀后，置于 37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应 24h；到时后迅速加入 1mL 试剂二充分混匀，以 终止酶催化的反应。10000rpm 室温离心 10min ，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤：

(1)  分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 660 nm ，蒸馏水调零。

(2)  空白管：取微量比色皿/酶标板，加入 10 µL 试剂一，20 µL 试剂三，4 µL 试剂四，充分混  匀，显色后再加蒸馏水 166µL ，混匀后室温静置 30 min ，于 660 nm 测定吸光度，记为 A 空白管。

(3)  标准管：取微量比色皿/酶标板，加入 10 µL 标准液，20 µL 试剂三，4 µL 试剂四，充分混  匀，显色后再加蒸馏水 166µL ，混匀后室温静置 30 min ，于 660 nm 测定吸光度，记为 A 标准管。

(4)  测定管：取微量比色皿/酶标板，加入 10 µL 上清液，20 µL 试剂三，4 µL 试剂四，充分混  匀，显色后再加蒸馏水 166µL ，混匀后室温静置 30 min ，于 660 nm 测定吸光度，记为 A 测定管。 注意：空白管和标准管只需要测定一次。

S-AKP/ALP 活性计算：

活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放 1nmol 酚为 1 个酶活单位。

S-AKP/ALP  ( nmol/d/g ) =[C 标准液 ×(A 测定管－ A 空白管)÷(A 标准管－ A 空白管)]×V 总

÷W÷T×1000

=725×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

C 标准液：0.5 µmol/mL；  V 总：催化体系总体积，1.45mL；W：土壤样品质量，g；T ：催化 反应时间，24 h=1 d；1000：单位换算系数，1µmol=1000nmol。

注：线性范围为 0.03125µmol/mL-2.5µmol/mL

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