β-葡萄糖苷酶（β-GC)活性检测试剂盒说明书

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

规格：100T/48S

产品内容：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

微量法

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 12mL 双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体 1mL×1 支，5μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。

产品说明：

β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC 负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC 水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC 能够水解植物体内野黑樱苷，释放 HCN，从而防止昆虫取食。

β-GC 分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 1000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），15000g， 4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约 0.2g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。

3、标准样品的准备：取 100μL 标准液，加入到 400μL 试剂三中，得到 1μmol/mL 标准液，十倍稀释到 100nmol/mL，用蒸馏水倍比稀释：50、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做标准液。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2.加样表

试剂名称（μL）测定管对照管标准管

试剂一120

试剂二150150

样本3030

充分混匀，放入 37℃准确水浴 30min 后，立即放入沸水浴中煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变）

充分混匀，8000g，4℃，离心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）

充分混匀，室温静置 2min 后，400nm 处测定吸光值 A，计算ΔA=A 测定管-A 对照管。三、β-GC 活力计算：

1、标准曲线建立：根据标准管的浓度（y）和吸光度（减去浓度为 0 标准管的 OD 值，x），建立标准曲线。

2、根据标准曲线，将ΔA（x）带入公式计算样品产物浓度（nmol/mL）。

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(U/g 鲜重) = (y×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=20×y÷W

（3）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反总)÷(1000×V 样÷V 样总)÷T=0.02×y

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样品鲜重，g；1000：细胞或细菌总数，1000 万；T：反应时间，0.5h。

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