纤维素（CLL）含量试剂盒说明书

                         可见分光光度法

注意： 正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格：50T/48S

正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，是植物细胞

壁的主要结构成分。纤维素是一种重要的膳食纤维，是自然界中分布最广、含量最多的 一种多糖。

测定原理：

纤维素为β －葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β －葡萄糖。β －葡萄糖在强酸作 用下，可脱水生成β －糠醛类化合物。β －糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成糠醛衍生物。颜色的深  浅可间接定量测定纤维素含量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、浓硫酸（不 允许快递） 、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一： 液体 50mL× 1 瓶，4℃保存。

试剂二： 粉剂×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三： 液体 10mL× 1 支，4℃保存。

标准品： 粉剂10mg× 1支，4℃保存； 含 10mg 无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液备用，4℃可保存 1 周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解， 可保存更长时间。

样品的前处理：

1 、细胞壁的提取： 取约 0.3g 样本（计为M1），加入 1mL 80％乙醇，室温快速匀浆，95℃水浴      20min ，冷却至室温，4000g 25℃离心 10min ，弃上清。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍  （涡旋振荡 2min 左右，4000g 25℃离心 10min ，弃上清即可） ，沉淀即为粗细胞壁，加入 1mL 试 剂一（去除淀粉） 浸泡 15 小时，4000g 25℃离心 10min ，弃上清，1mL 80％乙醇洗涤两次，弃上 清，将沉淀干燥，称重得细胞壁物质（CWM质量计为M2）。

2 、纤维素的提取： 称取烘干的 CWM 约 5mg（计为W），加入 0.5mL 蒸馏水充分匀浆，匀浆液转移 至 EP 管中，用蒸馏水定容至 0.5mL ，置于冰水浴中，缓慢加入 0.75mL 浓硫酸，混匀，冰水浴中 静置 30min 。8000g 4℃离心 10min ，取上清液，用蒸馏水稀释 20 倍后待测。

标准溶液准备：

将10mg/mL 葡萄糖标准液进行二倍稀释得到 0.2、0. 1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、 0.00156mg/mL 标准溶液备用。

测定步骤：

1 、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 620nm ，蒸馏水调零。

本产品仅供科学研究使用！ 请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！

2 、调节水浴锅至 95 度。

3 、工作液的配制： 在试剂二中加入 4mL 试剂三，充分溶解，如较难溶解，可加热搅拌； 用 不完的试剂 4℃保存一周；

4 、加样表（在 EP 管中反应） ：

混匀，置 95度水浴中 10min（盖紧，以防止水分散失） ，冷却至室温后，于 620nm 处读数。 纤维素含量计算：

1 、标准曲线绘制：

以 0.2 、0. 1 、0.05 、0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.00156mg/mL 葡萄糖标准溶液为横坐

标，ΔA 为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程 y=kx+b ，将ΔA´代入方程得到 x（mg/mL）；

2 、按细胞壁干重计算

纤维素含量(mg/mg 鲜重)=x×稀释倍数×V 提取÷W

3 、按总样本质量计算

纤维素含量(mg/mg 鲜重)=x×稀释倍数×V 提取÷W×（M2÷M1）

V 提取： 提取后体积，1.25mL；W：样品质量，mg；稀释倍数： 20；M1：总样本质量，g； M2：细胞壁物质CWM ，g

注意事项

1. 加热过程中有剧烈反应，震荡时轻摇，以免压力过大喷出造成人生伤害。

2. 浓硫酸具有强腐蚀性，建议戴防护手套操作。

3. 如样本OD值大于1.5 ，可在纤维素提取过程中扩大稀释倍数，计数过程中乘以对应的稀释倍数。

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