CCK-8试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中待测物质水平。用纯化的待测物质抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的待测物质抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中待测物质浓度。

　　CCK-8试剂盒的技术流程：

　　1、用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。

　　2、加样：加一定稀释的待检样品0.05ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。

　　3、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.05ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

　　5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　CCK-8试剂盒使用注意事项：

　　（1）所有试剂应按照适合温度储存。请勿反复冻融。

　　（2）使用后均需要对操作区进行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除剂等。耗材均需使用商品化的无酶耗材。

　　CCK-8试剂盒样本注意事项：

　　（1）细胞在含/不含血清的环境中均可直接使用试剂盒。

　　（2）扩增2kb以内片段，细胞样品浓度不超过1000个细胞。如若扩增片段超过2kb，可适当提高细胞浓度。

　　（3）不同组织使用不同的眼科剪和眼科镊进行处理，防止交叉污染导致检测结果偏差。

　　CCK-8试剂盒使用过程中注意事项：

　　（1）PCR过程中推荐使用阴性对照和阳性对照。

　　（2）整个过程中使用的吸头、离心管等耗材应丢弃在含有75%乙醇或核酸消除剂的容器中，防止形成环境污染。

　　（4）PCR产物3’末端含有A，可直接进行TA克隆。