植物RNA提取试剂盒说明书

RNApure Plant Kit

 Cat. No.   K0588

保存：室温

组分说明

产品简介

     本试剂盒用于从各种植物中提取纯化高品质总 RNA，也适用于真菌菌丝 RNA 的提取。*的 Shredder 分离柱，用于匀质化和过滤高粘度的植物或真菌裂解物，同时采用硅基质膜吸附 RNA 进行纯化，使多聚糖等各种污染物通过洗涤被有效去除，经洗脱的 RNA 可直接用于各种下游实验。由本试剂盒提取 RNA 分子量大于 200 碱基，纯度高，几乎无 DNA 残留。如果是对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase I 在柱上进行消化去除。提取的RNA 可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和体外翻译等实验。

注意事项

1.  预防RNase污染，应注意以下几方面：

1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

3）配制溶液应使用无RNase的水。

4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量。

3.  Buffer RL 在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10  μl  β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL 室温可保存 1 个月。Buffer RLC 使用时不需加β-巯基乙醇。

4.  第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5.  Buffer RL 和 Buffer RLC 如果产生沉淀，请加热使其溶解后室温放置。

6.  所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

7.  若下游实验对 DNA 非常敏感，建议用不含 RNase 的 DNase I（货号：YJ2090A）对 RNA 进行处理。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）  

操作步骤

1.   取植物新鲜组织50-100 mg，加入液氮迅速研磨成粉末。

2.   将研磨后的粉末收集到离心管（自备）中，加入600  μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇）或Buffer RLC，涡旋振荡使其充分裂解。

     注意：1）Buffer RL主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解。但有些植物组织（如玉米的胚乳），由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳，此时可加入Buffer RLC替代Buffer RL。

            2）56℃孵育1-3分钟有助于组织的裂解，但是淀粉含量高的植物不要进行高温孵育。

3.   将步骤2所得全部液体转移至已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（Shredder Spin Column）中，12,000rpm（~13,400×g）离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管（自备）中。

     注意：1）在吸取液体时可以将枪头尖端剪掉，便于取样。

            2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍会有小部分流出，离心后会在收集管内形成沉淀，在进行下一步时注意避免吸到沉淀。

4.   在步骤3所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。

     注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。

5.

     将步骤4得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入。10,000 rpm（~11,500×g）离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.   向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

     可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤6。

     1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

     2）配制DNase I 混合液：取52  μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80  μl 的DNase I混合液。

         注意:  以上体系为按照我公司产品DNase I （K2090A）反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。

     3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。

     4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.   重复步骤7。

9.   12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

     注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

10.  将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入30-50  μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

 注意：1）  RNase-Free Water 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。

2）  如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤10。

3）  如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。

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