磺胺多残留

快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗磺胺类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物磺胺类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物磺胺类药物的含量。

二、试剂盒特性

u 试剂盒灵敏度：   0.4ppb

u 孵育温度：       25℃

u 孵育时间：       30min～15min

u 样本检测下限

组 织（高 检 测 限 方 法）  ··············· 0.4 ppb

蜂 蜜 ················································0.4 ppb

血 清 、 尿 液 ··································· 1.6 ppb

牛    奶 ·········································  8 ppb

u 交叉反应率

磺胺甲基嘧啶（SM₁ ） ·························  100%

磺胺嘧啶（SD或SDZ）·························  130.2%

磺胺间（六）甲氧嘧啶（SMM）················  181.8%

磺胺甲噁唑（SMZ）······························  86.6%

磺胺异噁唑（SIZ） ·······························  76.5%

磺胺噻唑（ST）··································  103.3%

磺胺喹噁林(SQX) ····························    59.4%

磺胺甲氧哒嗪(SMP) ····························  68.6%

磺胺氯吡嗪(Esb3)·······························  72.1%

磺胺氯哒嗪(SCPA)······························  49.6%

磺胺对甲氧嘧啶（SMD）·····················  194.8%

磺胺二甲基嘧啶（SM2） ····················   79.3%

磺胺二甲异嘧啶（SM2′）··················   100.6%

磺胺间二甲氧嘧啶（SDM） ·················  140.8%

磺胺邻二甲氧嘧啶（SDM′） ··············  132.1%

磺胺多辛（SDM2）······························  144.7%

酞酰磺噻唑（PST）································  73.9%

磺胺苯酰（SML）·································  104%

磺胺咪(SG) ········································  0.1%

由反应交叉率可以得出：该试剂盒可用于磺胺多种残留物的检测，*国家磺胺类多残留种类检测的要求。

u 样本回收率

组  织 、尿 样、牛 奶  ···············   85% ±25%

蜂 蜜、血 清  ···························   80% ±23%

三、试剂盒组成

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道 20µl～200µl、单道100µl～1000µl、多道 30～300 µl

试      剂：乙酸乙酯、Na₂HPO₄·12H₂O、乙腈、NaH₂PO₄·2H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、二氯甲烷、正己烷

五、样本前处理步骤

u 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u 样本前处理需配制：

配液1   0.1M K₂HPO₄溶液

称取11.4g  K₂HPO₄·3H₂O用去离子水500ml溶解。

配液2   0.02M PB缓冲液 

称取5.16g Na₂HPO₄·12H₂O和0.87g NaH₂PO₄·2H₂O加去离子水1L溶解。

配液3   乙腈-二氯甲烷混合液

V_乙腈-V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液4   样本复溶液：

将20X浓缩复溶液用去离子水1：19稀释。

u 样本处理：

（a）组织高检测限处理方法一

1、 称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中；加入8ml乙腈-二氯甲烷混合液，振荡2min，4000r/min以上，15℃离心10min；

2、 取4ml清澈有机相至干燥容器中，50-60℃氮气或空气吹干；

3、 用1ml样本复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml。混合30s，4000r/min以上15℃离心5min；去除上层正己烷；

4、 取下层50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  1倍 

（b）组织高检测限处理方法二

1、 称取3±0.05g匀浆物置离心管中，先加入3ml 0.02M PB缓冲液充分振荡混匀，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振荡10min，于15℃ 4000r/min以上速度离心10min；

2、 移取2ml上层液体（约相当于1g的样本）在50-60℃氮气或空气吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加入1ml样本复溶液强烈振荡1min，室温4000r/min，离心5min，除去上层正己烷；

4、 取下层50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  1倍 

（c）血清处理方法

1、 将血样本于室温放置30min，于10℃，4000r/min以上离心10min，分离出血清或过滤血清；

2、 取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB缓冲液混合，混合30s；

3、 取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  4倍 

（d）蜂蜜处理方法

1、 称取2±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中，加入2ml 0.1M K₂HPO₄溶液，涡旋震荡2min；

2、 再加入8ml乙酸乙脂，涡旋振荡3min，4000r/min以上15℃离心10min；

3、 取4ml上层液体于56℃下氮气吹干，加1ml 样本复溶液复溶，涡旋震荡1min；

4、 取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  1倍 

（e）尿液处理方法

1、 用3ml0.02 M PB缓冲液与1ml经离心后的清亮尿样本混合，混合30s；

2、 取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  4倍

（f）牛奶处理方法

1、 取1ml牛奶样本用0.02 M PB缓冲液按1︰19（v/v）稀释（即20µl牛奶+380µl 0.02 M PB缓冲液），混合30s；

2、 取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:  20倍

六、 酶标免疫分析程序:

u 测定前应须知：

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

u 操作步骤：

1、 从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：将40ml 20X浓缩洗涤液用去离子水稀释至800ml。

4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、 加标准品/样品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔，然后再加入抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，25℃环境中反应30min。

6、 将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液250µl/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 显色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：加入终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含磺胺类药物量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 0.4ppb为1.816；0.8ppb为1.415；1.6ppb为0.74；3.2ppb为0.313；6.4ppb为0.155。则样本1的浓度范围是3.2ppb～6.4ppb；样本2的浓度范围是0.8ppb～1.6ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺类药物实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以磺胺类药物标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺类药物实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、单项磺胺类检测结果计算

    将按照试剂盒计算出来的结果乘以相应的交叉反应率即为磺胺单项的检测值。

八、 注意事项

1、 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、 储藏条件：试剂盒于2～8℃保存，不要冷冻。

2、 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。

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