氯——#霉素

快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氯霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物氯霉素的含量。

二、试剂盒特性

u 试剂盒灵敏度：   0.02ppb

u 孵育温度：       25℃

u 孵育时间：       30min～30min～15min

u 样本检测下限

蛋类、牛奶（方法一） ···························· 0.04ppb

尿液、血清、肠衣、饲料、奶粉··················· 0.02ppb

组织、肝脏、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.01ppb

u 交叉反应率

氯+#霉素·     ······································· 100%

甲砜+#霉素   ······································ < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

u 样本回收率

组织、肝脏 ································  85%±20%

蜂蜜、肠衣 ································  83%±25%

牛奶、饲料 ································  75%±23%

尿液、血清 ································  70%±18%

三、试剂盒组成

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、恒温箱

微量移液器：单道 20～200µl、单道100～1000µl、多道 30～300 µl

试      剂：乙酸乙酯、乙腈、亚硝基铁氰+#化钠、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸锌、醋酸钠、正己烷、醋酸

五、样本前处理步骤

u 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u 样本前处理需配制：

配液1 C液（牛奶、奶粉样本）：

10.7g 亚硝基铁氰+#化钠加去离子水100ml溶解。

配液2  D液（牛奶、奶粉样本）：

28.8g硫酸锌加去离子水100ml溶解。

配液3 pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液（尿样本）：称2.4g醋酸钠和1.2ml醋酸加去离子水500ml溶解混合。

配液4 乙腈-水溶液：

 V_乙腈：V_H2O＝84：16

配液5 样本复溶液：

将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶液+1份去离子水，用于抗体的稀释和样本提取后的复溶)。

u 样本处理：

（a）组织、肝脏样本处理方法

1、 称取均质后的样本3±0.05g于50ml离心管中，先加入3ml去离子水混匀后再加入6ml乙酸乙酯，振荡2min，室温4000r/min以上离心10min；

2、 取出4ml上层液体在50-60℃氮气流中吹干；

3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml样本复溶液混合30s，室温4000r/min以上离心5min；去除上层有机相；

4、 取50 µl下层相用于分析。

样本稀释倍数:  0.5倍

（b）血清血浆处理方法

1、 取1ml血清或血浆至试管中，加2ml乙酸乙酯振荡1min；静置使水相与有机相分层或室温4000r/min离心5min；

2、 移取上层的乙酸乙酯至另一试管中，用氮气流50℃水浴中干燥；残留物用1 ml样本复溶液溶解，混合30s；

3、 取50 µl下层相用于分析。

样本稀释倍数:  1倍

（c） 尿液处理方法

1、 移取2ml尿液到离心管中，加pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液0.5ml混合；加40µl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)到稀释的尿液中，在37℃水解至少2小时（或过夜）；

2、 该溶液恢复至室温后加入8ml乙酸乙酯混合1min；室温4000r/min离心10min，取出4ml上层液体在氮气下50～60℃干燥；

3、 用1ml样本复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；

4、 取50µl 用于分析。

样本稀释倍数:  1倍

（d）蜂蜜处理方法

1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入离心管中，用4ml去离子水溶解；加入4ml乙酸乙酯振荡2min，室温4000r/min以上离心10min；

2、 移取2ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥；用0.5ml样本复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；

3、 取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：  0.5倍  

检测下限：0.025ppb      定量下限：0.1 ppb

注：我们推荐0.1 ppb为阳性样本的cut off值。

（e）肠衣处理方法

1、 用均质器均质样本；注：干样本需剪碎（长度不超5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂洗20min以上去除表面的盐份，沥干后再均质；

2、 称1±0.05g均质后的样本于50ml离心管中，加入10ml乙酸乙酯，振荡2min，室温4000r/min以上离心10min；

3、 取5ml上层液体（相当于0.5g的样本）在氮气流下50-60℃干燥；

4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加0.5ml样本复溶液振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min；除上层有机相；

5、 取下层50 µl用于分析。

样本稀释倍数：  1倍

（f）牛奶样本处理方法一

1、 将牛奶样本10℃4000r/min以上离心10min处理，吸除上层脂肪；然后取5ml去除脂肪奶样至50ml离心管中，加入150µl C液出现沉淀，短暂振荡后加入150µl D液混合；

2、 15℃4000r/min以上离心10min，移取上层液；用样本复溶液以等体积稀释上层液，混合30s；

3、 取50µl用于分析。

注：如果离心后仍然浑浊，再重复沉淀过程。

样本稀释倍数：2      

检测下限：0.1ppb   定量下限：0.15ppb

（g）牛奶样本处理方法二

1、 将牛奶样本10℃4000r/min以上离心10min处理，吸除上层脂肪；然后取5ml去除脂肪奶样至50ml离心管中，加入250µl C液和250µl D液*混合，4-12℃4000r/min以上离心10min。如无冷冻离心机，将样本置冰箱中冷却到8℃；

2、 转移出2.2ml上层液（相当于2ml奶样）至新的离心管中，加入4ml乙酸乙酯上振荡2min；室温（20-25℃）4000r/min以上离心10min ；

3、 吸取2ml乙酸乙酯上层液体（相当于1ml奶样），50-60℃氮气流下*干燥；用0.5ml样本复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；

4、 取50µl用于分析。

样本稀释倍数：0.5

检测下限：0.025ppb    定量检测限：0.05ppb

由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些

情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3作为阳性结果的CUT OFF判断值。

（h）奶粉样本处理方法

1、 称2±0.05 g奶粉至50ml离心管中，加入10ml去离子水振荡溶解；加入1ml C液和1ml D液*混合；4-12℃4000r/min以上离心10min。若无冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃；

2、 转移出3.6ml上层液（相当于0.6g奶粉）至新的离心管中，加入6ml乙酸乙酯振荡5min；室温（20-25℃）4000r/min以上离心10min；

3、 吸取4ml乙酸乙酯上层液体（相当于0.4g奶粉），50-60℃氮气流下*干燥；用0.4ml样本复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；

4、 取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：1    

检测下限：0.05ppb     定量检测限：0.15ppb

由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3作为阳性结果的CUT OFF判断值。

（i）蛋类处理方法

1、 称取3±0.05 g均质的样本，加入9ml乙腈-水溶液振荡2min，15℃4000r/min以上离心10min；

2、 取3ml上层相与3ml去离子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合1min，15℃4000r/min以上离心10min；取上层有机相置50-60℃下氮气流吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解残留物后，用2ml样本复溶液混合30s，室温4000r/min以上离心5min；去除上层有机相；

4、 取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：2    

检测下限：0.1ppb     定量检测限：0.3ppb

（j）饲料处理方法

1、 称取2±0.05g均质过的饲料样本，加入2ml去离子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振荡2min，15℃ 4000r/min以上离心10min；

2、 取3ml上层有机相到试管中56℃下氮气吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解残留物，用1ml样本复溶液混合30s，室温4000r/min以上离心5min；去除上层有机相；

4、 取50 µl用于分析。

样本稀释倍数：1

六、 酶标免疫分析程序:

u 测定前应须知：

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

u 操作步骤：

1、 从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、 将浓缩抗体用样本复溶液11倍稀释（1份抗体加入10份稀释液，按需配制使用）

6、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

7、 将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液250µl/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4～5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

9、 显色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

10、 测定：加入终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含氯霉素量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 0.02ppb为1.816；0.06ppb为1.415；0.18ppb为0.74；0.54ppb为0.313；1.62ppb为0.155。则样本1的浓度范围是0.54ppb～1.62ppb；样本2的浓度范围是0.06ppb～0.18ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

八、 注意事项

1、 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、 储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。

2、 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。

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