甲基化DNA检测试剂盒说明书

DNA Methylation Kit

目录号：K2140

保存：室温

组分说明

Cat. No.                        K2140               K2140A

Kit Size                          10                    50

CT Conversion Reagent             10 reations          50 reations

M-Dissolving Buffer          10 reations（100 μl）     50 reations（粉末）

M-Dilution Buffer                  400 μl               2 ml

M-Buffer PA                       15 ml                60 ml

M-Wash Buffer（concentrate）        2 ml                 15 ml

M-Elution Buffer                    1 ml                 10 ml

Buffer PS                          5 ml                 15 ml

Spin Column DS                     10                  50

Collection Tube（2ml）               10                  50

产品简介

    本试剂盒采用高温处理方法，缩短了转变时间，提高了转变效率，转变效率可达到 99%以上。经过 DNA亚硫酸氢盐转变，可回收得到大量 DNA。本试剂盒基本原理为 DNA 经亚硫酸氢钠处理后，可使未甲基化的胞嘧啶转变为

尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。

    本试剂盒采用硅基质膜式纯化柱通过简单的结合-洗涤-洗脱步骤，可从甲基化修饰后的溶液中回收纯化 DNA，回收的DNA 纯度高，完整性好，可直接用于测序、甲基化 PCR 检测、芯片分析、连接和转化、酶切、标记、显微注射、PCR 和体外转录等各种分子生物学实验。

注意事项

1.   产品配用方法：

（1）10次包装配制方法：CT Conversion Reagent是固体混合物，一定要在第—次使用前制备好。将2 ml  无菌水、100μl M-Dissolving Buffer和300  μl M-Dilution Buffer加入到CT Conversion Reagent管中。 在55°C溶解并震荡直至全部溶解。在使用之前将 CT Conversion Reagent 溶液在室温(20°C -30°C)下避光保存。每管的CT Conversion Reagent是针对10次DNA 处理设计的，为了得到较好的结果, CT Conversion Reagent应当在制备后立即使用，如果不立即使用，可将CT Conversion Reagent  溶液在-20°C存储1周，使用前，请务必将存储的CT Conversion Reagent 溶液在室温下解冻，并且通过振动或颠倒2分钟以充分混匀，CT Conversion Reagent对光很敏感，所以要尽量减少在光下的暴露。

（2）50 次包装配制方法：CT Conversion Reagent、M-Dissolving Buffer 均固体混合物，一定要在第—次使用前制备好。将 5ml 无菌水加入到 M-Dissolving Buffer 中震荡溶解，待固体全部溶解后将 M-Dissolving Buffer 管中溶液全部转移至CT Conversion  Reagent 管中同时补加 5.5ml 无菌水。再将 1.5ml M-Dilution Buffer 加入到 CT Conversion  Reagent

管中。在 55°C 溶解并震荡直至全部溶解。在使用之前将 CT Conversion Reagent  溶液在室温 (20°C -30°C)下避光保存。每管的  CT Conversion Reagent 是针对 50 次 DNA  处理设计的，为了得到较好的结果, CT Conversion Reagent 应当在制备后立即使用，如果不立即使用，可将  CT Conversion Reagent 溶液在-20°C 存储 1 周，使用前，请务必将存储的 CT Conversion Reagent 溶液在室温下解冻，并且通过振动或颠倒 2 分钟以充分混匀，CT Conversion Reagent 对光很敏感，所以要尽量减少在光下的暴露。

2.  第一次使用前应安装试剂瓶标签的说明先在M-Wash Buffer中加入无水乙醇。

自备试剂：无水乙醇、75%乙醇

操作步骤

每次制备的 DNA 范围在  1 ng-4  μg 之间，最佳量为 500 ng-2μg。

1. 取 20 μl DNA 样品，加入到离心管（自备）中，如果样品量不足，用水补至 20μl。

2. 向 DNA 样品中加入 2.2 μl  的 M-Dilution Buffer，混匀样品。

3. 42℃水浴 30 分钟。

4. 向上步得到的样品中，加入 220 μl 配制好的  CT  Conversion  Reagent 溶液，混匀，80℃恒温水浴锅中避光孵育 60分钟。

5. 向上步溶液中加入 480 μl M- Buffer PA，温和上下颠倒混匀。

6. 柱平衡：向已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column CS）中加入 200  μl Buffer PS，12,000 rpm（~13,400×g）离心 2 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7. 将步骤 5 所得溶液全部加入到吸附柱（已装入收集管）中，室温放置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

   注意：吸附柱最大容量为700  μl，若样品体积大于700 μl可分批加入  。

8. 向吸附柱中加入 500 μl M- Buffer PA，12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，  将吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入 650 μl  M-Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

10. 12,000 rpm 离心 2 分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

   注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）

11. 将吸附柱放入一个新的离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加 20 μl M-Elution Buffer（pH  8.5），室温放置 2 分钟。12,000 rpm 离心 1 分钟收集 DNA 溶液。

12. 向收集的 20 μl DNA 中加入 2.2  μl M-Dilution Buffer，室温静止 30 分钟。

13. 向溶液中加入 500 μl 预冷的无水乙醇颠倒混匀，沉淀 30 分钟（建议置于-20℃沉淀，过夜沉淀效果更好）。

14. 12,000 rpm 离心 15 分钟，轻轻倒掉上清，再用 75%乙醇洗涤一次。

15. 12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉上清，室温下待乙醇挥发后，加入 20 μl M-Elution Buffer 溶解，DNA 置于-20℃保存。此步收集的 DNA 可以用于后续相关实验。

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