动物组织/细胞RNA提取试剂盒（DNase I）说明书

RNApure Tissue Kit（DNase I）

动物组织/细胞RNA提取试剂盒（DNase I）

目录号：K0560

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

       其它组分：室  温

组分说明

     Cat.No.                         K0560

     KitSize                           50

     DNaseI                         1000U

     10×ReactionBuffer           1000μl

     BufferRL                       35ml

     BufferRW1                     40ml

     BufferRW2（concentrate）   11ml

     RNase-FreeWater              10ml

     SpinColumnRM                 50

     CollectionTube（1.5ml）     50

     CollectionTube（2ml）     50

产品简介

     本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总 RNA。起始样本一般最多 30mg 组织或 1x107   细胞。本试剂盒还可回收未*纯化的 RNA、体外转录和酶促反应后得到的 RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于 200 碱基的高品质 RNA，几乎无 DNA 残留。如果要进行对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase 在柱上进行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游实验。

注意事项

1.  预防RNase污染，应注意以下几方面：

    1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

    3）配制溶液应使用无RNase的水。

    4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量。

3.  BufferRL 在使用前请加入β-巯基乙醇，1mlBufferRL 加 10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 BufferRL 室温可保存1 个月。

4.  第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 BufferRW2 中加入无水乙醇。

5.  BufferRL 如果产生沉淀，可于 56℃加热使其溶解后室温放置。

6.  所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

自备试剂：  β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）  

操作步骤

1.  样品处理

    1a. 组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600  μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350  μl Buffer RL。样品体积不超过BufferRL体积的十分之一。

1b 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10 cm ²培养面积加入600  μl Buffer RL，小于6 cm² 加入350  μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。

   1c. 细胞悬液：12,000rpm6（～13,400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×10⁶ -1×10⁷ 细胞加入600 μl Buffer RL ，少于5×10⁶细胞加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。

注意：1）尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。

2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。

2.  样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物*分离。

3.  12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

4.  向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积（600  μl 或350  μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。

   注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。

5.  将上步所得溶液全部加入到吸附柱（SpinColumnRM）中（吸附柱已装入收集管CollectionTube中），若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。

    注意：吸附柱的最大载量为100µg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。

6.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.  配制DNaseI 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混匀，配制成终体积为80 μl的反应液。

8.  向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

9.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer  RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）,12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废

液，将吸附柱放回收集管中。

11.  重复步骤10。

12.  12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

   注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

13.  将吸附柱转入新的RNase-Free的1.5ml 收集管中，向吸附膜中间位置加入30-50  μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤13。

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。

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