AxyPrep 无内毒素质粒大量试剂盒
本试剂盒采用 SDS 碱裂解法，结合DNA制备膜选择性吸附DNA。同时采用特殊溶液（Buffer ETR和 Buffer PF）有效去除内毒素，可从 80-200 ml 细菌培养物中提取出多至 500 礸高纯度质粒DNA，其内毒素水平控制在0.1 EU/礸以下。
一、 试剂盒组成、贮存、稳定性
|
| Cat. No. | AP-MX-EP-2 | AP-MX-EP-10 | AP-MX-EP-25 | |||
|
| 制备次数 | 2 preps | 10 preps | 25 preps | |||
|
| 制备管（Maxiprep column） |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
|
| 大量滤器（Maxiprep syringe filter） |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
|
| RNase A | 48 µl | 270 µl | 700 µl | |||
|
| Buffer S1 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
|
| Buffer S2 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
|
| Buffer S3K | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
|
| Buffer B | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
|
| Buffer W1 | 3 | ml | 160 | ml | 350 | ml |
|
| Buffer W2 concentrate | 15 | ml | 66 | ml | 150 | ml |
|
| ET-free water (70% Ethanol) | 1.8 | ml | 7.5 | ml | 18 | ml |
|
| Eluent A | 8 | ml | 30 | ml | 70 | ml |
|
| Buffer ETR | 10 | ml | 50 | ml | 120 | ml |
|
| Buffer PF | 3 | ml | 13 | ml | 30 | ml |
|
| 说明书 |
| 1 |
| 1 |
| 1 |
RNase A：50 mg/ml，室温可贮存 6 个月，长期贮存于-20℃。
Buffer S1：细菌悬浮液。加入 RNase A 后，混合均匀，4℃贮存。
Buffer S2：细菌裂解液（含 SDS/NaOH），室温密闭贮存。
Buffer S3K：中和液，室温密闭贮存。
Buffer B：DNA 结合溶液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上的体积加入无水乙醇（可用无水乙醇或 95%乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。
ET-free water (70% Ethanol)：使用前，按试剂瓶上的体积加入无水乙醇（可用无水乙醇或 95%乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent A：洗脱液。室温密闭贮存。
Buffer ETR：内毒素去除液。室温密闭贮存。
Buffer PF：分相缓冲液。室温密闭贮存。
二、 注意事项
细菌过量将影响细菌裂解、质粒 DNA 的释放，导致内毒素含量过高。
步骤 3 和步骤 4 的操作必须温和。剧烈摇晃将导致基因组 DNA 的污染。但混合必须充分，否则影响得率。
在加入 Buffer S3K 时，蛋白质和基因组 DNA 形成粘稠的白色絮状沉淀，必须充分混合均匀，使凝集块中间也得到充分中和凝结。
Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和防护眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣物，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
三、 实验准备
次使用前，RNase A 全部加入 Buffer S1 中，4℃贮存。
次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入体积的无水乙醇。
次使用前，ET-free water (70% Ethanol)中加入体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。
使用前，检查 Buffer S2 是否出现沉淀，如出现沉淀，应于 37℃温浴加热溶解并冷却至室温后使用。
Eluent A 在 65℃预热后使用，有利于提高质粒得率。
Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃预冷。
准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头、50ml 离心管。
水平离心机（转速可达到 4,000×g）及冷冻离心机（转速可达到 8,000×g）
准备 56℃水浴。
四、 操作步骤
- 取 80-200 ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），3,000 ×g 离心 8 min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上 1 min，除尽上清。
- 一般过夜培养的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之间。若菌液 OD600 >4，菌量需减少。
加 10 ml Buffer S1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
确认 Buffer S1 中已加入 RNase A。
- 加 10 ml Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。
- Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。
避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 污染。
此步骤不宜超过 5 min。
- 加 10 ml 4℃预冷的 Buffer S3K，温和并充分地上下翻转混合，直至溶液颜色均一并形成紧实的凝集块，室温放置 5 min。
- 加入 Buffer S3K 后应立即混合，以避免形成局部的凝结块。
避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 污染。
5.加 10 ml 4℃预冷的 Buffer B，温和并充分地上下翻转混合 10 次，8,000×g 离心（4℃）10 min。
步骤 6-9 可以选择离心法或负压法。
- 离心法：
6A. 先将大量制备管放入 50 ml 离心管中。吸取步骤 5 中的混合液，转移到大量滤器（Maxiprepsyringe filter）中。
7A. 插入推杆，垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。 8A. 弃滤液，加 12 ml Buffer W1 至制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。
9A. 弃滤液，加 14 ml Buffer W2 至制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。
- 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。
- 负压法：
6B. 正确连接负压装置，将大量制备管插到负压装置的插口上。
7B. 吸取步骤 5 中的上清液，转移到大量滤器中，插入推杆，垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中，开启并调节负压至-25 ~ -30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。
8B. 保持负压，加 12 ml Buffer W1，吸尽管中溶液。
9B. 保持负压，加 14 ml Buffer W2，吸尽管中溶液。
确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。
再在大量制备管中加 4 ml Buffer W2，≥6,000×g 离心 5 min。
将制备管置于另一洁净 50 ml 离心管中，在制备管膜中央加 2 ml Eluent A，室温静置 5 min，≥6,000×g 离心 5 min 收集质粒 DNA。
将 Eluent A 加热至 65℃将提高洗脱效率。
弃制备管。在滤液中加入 4 ml 预冷的 Buffer ETR，混合均匀。
如果 Buffer ETR 浑浊，于冰上静置，直至溶液变得清亮；如果分层，则混合均匀。
加入 1 ml Buffer PF，混合均匀。
*溶液可能会出现微弱的浑浊现象，此为正常现象。
置于 56°C 孵育 8 min。室温 4,000×g 离心 5 min。
孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀，否则延长孵育时间。
孵育后溶液有可能出现分层现象，此为正常现象。
此步骤的离心必须使用吊篮式（swing-out rotor）离心机或其他水平离心机
取无色上相至 50 ml 离心管中，加入 0.8 倍体积异丙醇（如：取得 6 ml 无色上相，则加入 4.8 ml 异丙醇），混合均匀。室温静置 10 min。8,000×g 离心 10 min。
尽可能弃尽上清。加入 2 ml 预冷的 ET-free water（70% Ethanol），洗涤沉淀，8,000×g 离心 5 min。
ET-free water（70% Ethanol）使用前确定已加入体积的无水乙醇。
尽可能弃尽上清。在超净台中干燥 10-15 min。
管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。
加入 500 祃 Eluent A 或无内毒素水溶解质粒 DNA。
