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黄曲霉M1快速检测试剂盒说明书
点击次数:1876 更新时间:2019-05-09

黄曲霉M1快速检测试剂盒说明书

 

一、原理

 

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法,在微孔条上预包被偶联抗原,样本中的残留物黄曲M1将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲M1抗体,加入酶标记物后,用 TMB 底物显色,样本吸光值与其所含残留物黄曲M1的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出相应残留物黄曲M1的含量。

 

二、试剂盒特性

 

  1. 试剂盒灵敏度:  0.03ppb

 

u 孵育温度: 25

 

u 孵育时间: 30min15min

 

  1. 样本检测下限

 

······································ 0.3 ppb

 

······································ 0.12ppb

 

  1. 交叉反应率

 

黄曲 M1 ···································· 100%

 

  1. 样本回收率

 

··································

90±25%

··································

85±25%

三、试剂盒组成

 

 

 

 

 

 

1

微量测试孔

每条 8 孔,一板 12 条

 

 

 

 

 

 

标准液×6 瓶

0ppb

0.03ppb

2

0.06ppb

0.12ppb

1ml/瓶)

 

0.24ppb

0.48ppb

 

 

 

 

 

 

 

3

酶标记物

7ml

红色帽

 

 

 

 

4

抗体工作液

7ml

蓝色帽

 

 

 

 

5

底物 A 液

7ml

白色帽

 

 

 

 

 

 

6

底物 B 液

7ml

黑色帽

 

 

 

 

7

终止液

7ml

黄色帽

 

 

 

 

8

20X 浓缩洗涤液

40ml

白色帽

 

 

 

 

9

2X 浓缩复溶液

50ml

透明帽

 

 

 

 

 

四、所用仪器、试剂

 

具备的仪器:酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量 0.01g)、氮吹仪、恒温箱、打印机微量移液器:单道 20200µl、单道 1001000µl多道 30300 µl

剂:乙腈、乙酸乙酯

 

五、样本前处理步骤

 

  1. 样本处理前须知

 

a)实验中必须使用一次性吸头,吸取不同试剂时要更换吸头。

 

b)实验之前须检查各种实验器具是否干净,必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实验结果。

 

  1. 样本前处理需配制:配液 1 样本复溶液:

用去离子水将 2×浓缩复溶液按 11 稀释。

 

配液 2  样本提取液:

 

将乙腈与乙酸乙酯按 1:2 比例混合均匀(1份乙腈+2 份乙酸乙酯)。

  1. 样本处理:

 

a)牛奶样本处理方法(适用于乳饮料)

 

1、 取牛奶样本 100µl,加入 900µl 去离子水,充分

 

振荡混匀;2、 取 50µl 用于分析。

 

样本稀释倍数:  10 倍

 

b) 奶粉样本处理方法:

 

1、 取 1.0±0.05g 奶粉样本于 50ml 离心管中;加入3ml 去离子水,再加入 8ml 样本提取液,充分振荡 3min20 4000r/min 以上离心 10min2、 移取 2ml 上层清澈液到另一离心管中,50-60氮气流下干燥;3、 用 1ml 正己烷溶解干燥的残留物,再加入 1ml样本复溶液充分混合 30s20 4000r/min 以上离心 10min;去除上层正己烷相;

 

4、 取 50µl 用于分析。

 

样本稀释倍数:4 倍

 

六、 酶标免疫分析程序:

 

  1. 测定前应须知:

 

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温(2025)。

 

2、 使用之后立即将所有试剂放回 28

 

3、 在 ELISA 分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。

 

4、 所有恒温孵育过程,避免光线照射,用盖板膜盖住微孔板。

 

  1. 操作步骤:

 

1、 从 28冷藏环境中取出所需试剂,室温(2025)平衡 30min 以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

 

2、 取出框架及需要数量的微孔,将不用的微孔放入自封袋,保存于 28

 

3、 配液:将 40ml 浓缩洗涤液(20 倍浓缩)用去离子水按照 119 稀释(1 份浓缩洗涤液+19 份去离子水),或按所需用量配制洗涤液。

 

4、 编号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2 孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。

 

5、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶标记物 50µl/孔,再加入 50µl/孔的抗体工作液,用盖板膜盖板,轻轻振荡混匀,25℃环境反应 30min

 

6、 将孔内液体甩干,用稀释后的洗涤液 250µl/孔洗板 45 次,每次间隔 1530 秒,用吸水纸拍干(拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

 

7、 显色:加入底物 A  50µl/孔,再加入底物 B 50µl/孔,轻轻振荡混匀,25环境中避光显15min

 

8、 测定:加入终止液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于 450nm 处(建议用双波长 450/630n m 检测,5min 内读数),测定每孔 OD 值。

 

七、结果判定

 

结果判定有两种方法,粗略判定可用第 1 种方法,定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含黄曲M1 量成负相关。

1、粗略判定:

 

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3,样本 2 的吸光度值为 1.0,标准液吸光度值分别是:

 

0ppb  2.2430.03ppb  1.8160.06ppb  1.415 0.12ppb  0.740.24ppb  0.3130.48ppb  0.155。则样本 1 的浓度范围是 0.24ppb0.48ppb;样本 2

 

的浓度范围是 0.06ppb0.12ppb,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲M1 实际浓度。

 

2、定量分析

 

1)百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以个标准(0 标准)的吸光度值,再乘以 100%,即

 

B

百分吸光率(%)= ×100%

B0

 

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

 

B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标,以黄曲M1标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲M1 实际浓度。

 

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样本的准确、快速分析. 

八、 注意事项

 

1、 室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温(20

 

25℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会伴随着标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

 

3、 混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。

 

4、 反应终止液为 2M 硫酸,避免接触皮肤。

 

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒;稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化;不要交换使用不同批号的盒中试剂。

 

6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封;标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

 

7、 显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。标准品1 的吸光度值小于 0.5 时,表示试剂可能变质。

 

8、 该试剂盒理想反应温度为 25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

 

九、储藏条件和保质期

 

1、 储藏条件:试剂盒于 28保存,不要冷冻。

 

2、 保 质 期:该产品有效期为 1 年,生产日期见包装盒。

 

提示:酶标板真空包装袋若有漏气,酶标板仍然正常有效,不影响实验结果,请放心使用。

 

农业部生物毒素检测重点实验室       联合研制     

 

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沪公网安备 31011802001678号

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