EF39A\K4                     2018-01版

黄曲霉毒素B1

快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉毒素B1将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物黄曲霉毒素B1的含量。

二、试剂盒特性

1. 试剂盒灵敏度：   0.02ppb
2. 孵育温度：       25℃
3. 孵育时间：       30min～15min
4. 样本检测下限

饲料 大米、玉米、花生、组织、食用油··········· 2 ppb

1. 交叉反应率

黄曲霉毒素B1 ······································ 100%

黄曲霉毒素M1 ······································ 6.6%

黄曲霉毒素B2 ····································· 54.5%

黄曲霉毒素G1 ······································· 8.4%

黄曲霉毒素G2 ······································· 1.7%

1. 样本回收

饲料 大米、玉米、花生、组织、食用油 ······· 95±35%

• 试剂盒组成

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、恒温箱、打印机

微量移液器：单道 20～200µl、单道100～1000µl、多道 30～300 µl

试      剂：甲醇、正己烷

五、样本前处理步骤

1. 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

1. 样本前处理需配制：

配液1  样本复溶液： 

用去离子水将20×浓缩复溶液按1：19稀 

释（1份20×浓缩复溶液+19份去离子水）。

配液2  样本提取液： 

将甲醇与去离子水按7:3比例混合均匀（7份甲醇+3份去离子水）。

1. 样本处理：     

（a）组织、饲料、大米、玉米样本处理方法：

1. 取1.0±0.05g研碎的样本于50ml离心管中；加入5ml样本提取液，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离心10min；
2. 取上清100µl，加入700µl样本复溶液，充分振荡混匀；
3. 取50µl用于分析。

  样本稀释倍数：40倍  

（b）食用油样本处理方法：

1. 取1.0±0.05g食用油样本于50ml离心管中；加入5ml样本提取液，再加入4ml正己烷，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离心10min；
2. 去掉上清，取中间层液体100µl，加入700µl样本复溶液，充分振荡混匀；
3. 取50µl用于分析。

  样本稀释倍数：40倍  

（c）花生样本处理方法：

1.    取1.0±0.05g研碎的花生样本于50ml离心管

     中；加入5ml样本提取液，再加入4ml正己

     烷，充分振荡3min，20℃ 4000r/min以上离

     心10min；

1.   去掉上清，取中间层液体100µl，加入400µl

    样本复溶液，充分振荡混匀；

3.   取50µl用于分析

    样本稀释倍数：25倍   

六、 酶标免疫分析程序:

1. 测定前应须知：

1. 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2. 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3. 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4. 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

1. 操作步骤：

1. 从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2. 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
3. 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
4. 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5. 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min。
6. 将孔内液体甩干，用稀释后的洗涤液250µl/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
7. 显色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
8. 测定：加入终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 0.02pb为1.816；0.06ppb为1.415；0.18ppb为0.74；0.54ppb为0.313；1.62ppb为0.155。则样本1的浓度范围是0.54ppb～1.62ppb；样本2的浓度范围是0.06ppb～0.18ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

八、 注意事项

1. 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3. 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4. 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5. 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6. 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7. 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
8. 该试剂盒理想反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1. 储藏条件：试剂盒于2～8℃保存，不要冷冻。
2. 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。